DT3C-ADC抗體內化效率體外檢測新工具
日期：2022-03-30 11:17:23
2014年MikiYamaguchi等人通過基因重組技術生產的一種重組蛋白，主要用于體外檢測癌細胞對mAb的內化效率，進而篩選出更有效的單克隆抗體。該蛋白包括一個沒有受體結合域的白喉毒素diphtheria toxin (DT)和鏈球菌蛋白G（Streptococcus protein G）的C1、C2、C3 (3C)結構域，即DT3C。DT3C是繼Mab-ZAP之后檢測細胞內化mAb效率的有效工具，文獻數據顯示，與mAb-Mab-ZAP相比，mAb-DT3C模擬的抗體偶聯藥物( Antibody-Drug Conjugate，ADC)具有易制備、分子量穩定及抗體內化效率高等特點[1]。為了進一步驗證DT3C在ADC抗體藥內化效率檢測中的作用，2015年，MikiYamaguchi等人又利用DT3C作為工具篩選了一種靶向胰腺導管腺癌細胞的anti-Mucin 13單克隆抗體[2]。據不完全統計，目前DT3C作為檢測mAb內化能力的工具已經用于近130項ADC藥物mAb篩選專利中，那DT3C究竟是如何介導ADC藥物mAb內化效率檢測的呢？
1、什么是ADC藥物內化？
在細說DT3C是如何介導ADC藥物mAb內化效率檢測之前，我們先來了解下什么是ADC藥物mAb內化。ADC藥物由抗體、連接子和小分子毒素組成，是通過連接子（linker）將具有生物活性的小分子藥物偶聯至單克隆抗體上。單抗通過腫瘤細胞相關抗原的特異性和靶向性定位到腫瘤細胞表面，并通過內吞/內化作用進入細胞，連接子在細胞內低pH值或溶酶體蛋白作用下斷裂，釋放出具有活性的細胞毒藥物，破壞DNA或阻止腫瘤細胞分裂，從而對腫瘤細胞起到殺傷作用。該類藥物利用抗體的特異性靶向運輸藥物分子到靶組織發揮作用，將細胞毒藥物強大的細胞殺傷能力集中于腫瘤細胞，降低對正常組織的毒副作用。在ADC設計研發過程中，首要的是藥物靶點的選擇。對于藥物靶點的選擇，除了要在腫瘤過度表達外，另一個重要因素是內吞/內化的效率，這是藥物釋放活性所必需的。抗體能否被內化主要由靶點決定，而抗體內化的效率則與抗原密度、抗體親和力以及抗體與抗原結合表位密切相關。同一靶點的不同抗體也會表現出不同的內化效率。
2、DT3C如何介導ADC抗體藥物內化效率體外檢測？
如前所述，ADC藥物中抗體能否被內化是藥物效果評價的重要因素。這里你可能會疑問，ADC藥物中抗體的內化與單純的抗體藥物內化有區別嗎？為什么DT3C是專門針對的ADC藥物呢？首先，ADC藥物中抗體的內化與單純的抗體藥物內化肯定是有區別，首先ADC藥物的分子量是大于單純的抗體藥物的，相同條件下，二者的內化效率肯定是不一樣的。其次，DT3C替代的是ADC藥物分子中的小分子藥物，是一種免疫毒素，mAb-DT3C偶聯物模擬的是ADC藥物。如下圖所示：mAb-DT3C偶聯復合物識別并結合細胞表面抗原后，mAb-DT3C-抗原復合物被內化；然后DT3C被胞質弗林蛋白酶（furin protease）切割，DT3C的催化結構域被釋放到細胞質中。DT3C的催化結構域導致延伸因子(EF)-2的 ADP-核糖基化，隨后通過抑制蛋白質翻譯機制導致細胞毒性。
圖1. Mechanism of antibody:DT3C-induced cytotoxicity
作為ADC藥物抗體內化檢測工具，DT3C優勢可總結為以下三點：
第一，mAb-DT3C偶聯物制備簡單，僅在室溫下孵育30min就能形成，而且在體外可以發揮患者給ADC藥物后的功能；
第二，DT3C可與來自不同物種（如人、小鼠、兔、山羊）的任何 IgG 結合，形成 mAb-DT3C 偶聯物，從而進一步擴大了DT3C作為mAb抗體內化檢測工具的范圍；
第三，只有當偶聯物被靶細胞內化時，mAb-DT3C 偶聯物才會顯著降低細胞活力。
值得一提的是，在DT3C之前，Mab-ZAP是唯一能夠檢測細胞內化mAb 效率工具。 Mab-ZAP由小鼠抗體和核糖體失活蛋白皂草素組成。當 mAb-Mab-ZAP 偶聯物被細胞內化時，由于皂草素的毒性，細胞會發生凋亡。所以可以通過細胞的存活率來檢測mAb是否被細胞內化。但是，不能排除Mab-ZAP本身在一定程度上可能降低mAb內化效率，因為 Mab-ZAP是一種包含抗小鼠抗體的大分子。與Mab-ZAP相比，mAb-DT3C偶聯物的分子量穩定且小于mAb-Mab-ZAP。并且，相關實驗數據表明，mAb-DT3C內化效率高于mAb-Mab-ZAP。
3、ADC藥物內化途徑
目前，關于mAb-DT3C復合物內化的具體途徑暫無相關文獻報道。結合常規的ADC藥物內化途徑，一般來說，內化又稱為內吞，正常的內吞作用可分為三個階段：芽的形成、膜的彎曲和囊泡的成熟和膜的斷裂并釋放到細胞質中。ADC藥物內化途徑可按是否依賴于網格蛋白分為：網格蛋白介導的內吞作用和非網格蛋白介導的內吞作用。非網格蛋白介導的內吞作用又可進一步分為：小窩介導的內吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白/GPI-富集的早期內區室（CLIC/GEEC）和巨胞飲作用。多種內吞途徑有重疊的方面，因此內吞的過程一般是高度靈活和復雜的。這里以小窩介導的內吞作用為例：
網格蛋白介導的內吞作用（CME）包括幾個連續和部分重疊的步驟。對于質膜上的一些受體而言，CME可以組成型發生；其他受體則需要配體或抗體結合后啟動。當細胞質中的內吞衣殼蛋白開始聚集在質膜的內小葉上時，CME就開始了。衣殼蛋白通過從細胞質中招募并與額外的蛋白質接頭并相互作用，繼續組裝和生長。關鍵的銜接蛋白使膜彎曲，從而將內化受體/配體集中到一個“網格蛋白包被坑”（CCP）中。在CCP頸部因CCP內陷變大而收縮的點處會通過斷裂與質膜分離。肌動蛋白聚合有助于將CCP “向內”拉入細胞質，直到完全分裂，CCP 被釋放并變成網格蛋白包被的囊泡 (CCV)。最后，CCV外殼解體，CCV與內體融合，分揀到確定的亞細胞位置，或者可以循環回細胞表面 [3]。
參考文獻：
[1] Yamaguchi M, Nishii Y, Nakamura K, et al. Development of a sensitive screening method for selecting monoclonal antibodies to be internalized by cells [J]. Biochem Biophys Res Commun. 2014: 454(4):600-3.
[2] Nishii Y, Yamaguchi M, Kimura Y, et al. A newly developed anti-Mucin 13 monoclonal antibody targets pancreatic ductal adenocarcinoma cells [J]. Int J Oncol. 2015, 46(4):1781-7.
[3] Hammood M, Craig AW, Leyton JV. Impact of Endocytosis Mechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-Drug Conjugates (ADCs)-A Necessity for Future ADC Research and Development [J]. Pharmaceuticals (Basel). 2021 Jul 15;14(7):674.
