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怎么判斷流式抗體是否適用于特定樣本類型(如外周血單個核細胞、組織單細胞懸液、培養細胞),是否需要提前進行樣本兼容性測試?

日期:2025-09-17 14:20:10

    判斷流式抗體是否適用于特定樣本類型(如外周血單個核細胞 PBMC、組織單細胞懸液、培養細胞),需從抗體本身的特性參數、樣本的生物學特征兩方面綜合評估,而樣本兼容性測試是驗證適用性的關鍵步驟,無法完全通過理論判斷替代。以下是具體判斷邏輯和操作方法:

一、核心判斷依據:從抗體特性匹配樣本類型
    流式抗體的說明書(或供應商提供的技術文檔)是最直接的判斷依據,需重點關注以下6個關鍵參數,逐一匹配目標樣本的特性:
 
關鍵參數 與樣本類型的匹配邏輯 示例(錯誤匹配場景)
1.特異性識別的抗原表位 確認抗體針對的抗原在目標樣本中是否表達、且表位是否未被樣本處理破壞。 用識別“細胞內抗原(如轉錄因子Foxp3)”的抗體檢測未固定破膜的活細胞(表位被細胞膜遮蔽,無法結合);
用識別“膜表面糖基化修飾表位”的抗體檢測經高濃度蛋白酶(如胰酶)消化的組織單細胞懸液(表位被酶解,信號消失)。
2.樣本種屬匹配 抗體說明書會明確標注“適用種屬”(如Human/Mouse/Rat),需與樣本來源種屬完全一致。 用“小鼠CD4抗體”檢測人PBMC(無交叉反應,無信號);
部分抗體標注“交叉反應種屬”(如Anti-HumanCD3cross-reactswithMonkey),需確認是否覆蓋目標樣本種屬。
3.抗體克隆號 同一抗原的不同克隆號,可能因表位親和力、組織/細胞特異性差異,適用于不同樣本。 克隆號OKT3的抗人CD3抗體,對PBMC中T細胞識別效率高,但對組織單細胞懸液中活化T細胞的識別可能弱于克隆號UCHT1;
部分克隆號(如抗小鼠CD45的30-F11)對造血細胞特異性高,不識別非造血來源的培養細胞(如成纖維細胞)。
4.抗體形式(偶聯/未偶聯) 未偶聯抗體(需二抗檢測)需確認二抗的種屬來源與樣本無交叉(避免非特異性結合);偶聯抗體需確認熒光素在樣本處理中是否穩定。 用“兔抗人CD20未偶聯抗體”檢測兔來源的組織單細胞懸液,再用熒光二抗(抗兔IgG)檢測時,二抗會結合樣本中兔自身IgG,導致非特異性熒光。
5.推薦的樣本處理方案 說明書會標注“推薦樣本類型”(如“適用于PBMC、培養細胞”)及配套的處理步驟(如是否需固定、破膜、酶解)。 說明書標注“適用于活細胞表面染色”的抗體,用于經4%多聚甲醛固定的組織單細胞懸液(固定可能導致抗原構象改變,抗體無法結合)。
6.參考文獻/應用案例 優先選擇有“目標樣本應用案例”的抗體(如供應商官網標注“已驗證用于人肺癌組織單細胞懸液的CD44檢測”),減少試錯成本。 若抗體僅標注“適用于培養細胞”,無組織樣本案例,直接用于腫瘤組織單細胞懸液時,可能因組織中雜質(如膠原、壞死細胞碎片)干擾,導致信噪比降低。

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二、不同樣本類型的特殊適配要求
    除通用參數外,PBMC、組織單細胞懸液、培養細胞的生物學特性差異較大,需針對性關注以下要點:
1. 外周血單個核細胞(PBMC)
    核心關注點:抗原是否為造血細胞特異性、避免紅細胞 / 血小板干擾。
        優先選擇 “造血細胞表面抗原抗體”(如 CD3/CD4/CD8/CD19 等),這類抗體對 PBMC 的特異性通常已驗證;
        若檢測細胞內抗原(如細胞因子、轉錄因子),需確認抗體適配 “PBMC 固定破膜方案”(如用 BD Cytofix/Cytoperm 試劑盒處理后,抗體是否仍能結合表位);
        避免使用 “易與紅細胞結合的抗體”(如抗 CD235a,僅用于紅細胞染色),防止殘留紅細胞干擾信號。
 
2. 組織單細胞懸液
    核心關注點:抗原是否耐受組織消化過程、是否存在組織特異性干擾。
        組織需經酶解(如膠原酶、透明質酸酶)或機械研磨制備單細胞懸液,需確認抗體針對的表位不被消化酶破壞(如糖蛋白類表位需避免長時間胰酶消化);
        部分組織(如肝臟、腎臟)含大量非靶細胞(如肝細胞、腎小管細胞)或細胞碎片,需選擇 “靶細胞特異性高的抗體”(如檢測腫瘤組織中的 T 細胞,優先用 CD3+CD45RO + 等組合標記,減少基質細胞干擾);
        脂肪組織、纖維組織等易產生粘性雜質,需確認抗體是否會與雜質非特異性結合(可通過 “空白對照” 觀察)。
 
3. 培養細胞(如貼壁細胞、懸浮細胞)
    核心關注點:細胞狀態對表位表達的影響、是否存在培養基成分干擾。
        貼壁細胞需經胰酶 / EDTA 消化后制成單細胞懸液,需確認抗體表位不被消化試劑破壞(如 EDTA 濃度過高可能影響鈣依賴的膜蛋白表位);
        部分培養細胞(如腫瘤細胞系)可能因傳代次數過多、培養條件(如缺氧、營養缺乏)改變,導致抗原表達量下降,需選擇 “高親和力克隆號的抗體”(如抗人 EGFR 的克隆號 C225,對低表達 EGFR 的培養細胞仍有良好信號);
        培養基中的血清成分(如牛 IgG)可能與抗體交叉反應,需用 “無血清培養基洗滌細胞后染色”,或選擇 “不與牛 IgG 交叉的抗體”(如山羊來源的一抗,二抗選擇抗山羊 IgG)。
 
三、必須進行的樣本兼容性測試:理論判斷無法替代
    即使抗體參數與樣本類型 “理論匹配”,仍需通過預實驗測試驗證兼容性,避免因樣本個體差異、處理過程波動導致實驗失敗。測試方案需包含以下 3 個核心對照和 1 個信號驗證步驟:

1. 設置關鍵對照,排除非特異性干擾
對照類型 目的 操作方法
對照類型 目的 操作方法
空白對照(Unstained Control) 確認樣本自身的自發熒光強度,避免將自發熒光誤判為特異性信號。 取未加任何抗體的目標樣本,按相同染色步驟處理后上流式儀檢測。
同型對照(Isotype Control) 確認抗體的非特異性結合(如抗體 Fc 段與樣本細胞表面 Fc 受體結合)。 選擇與待檢抗體 “種屬、亞型、偶聯熒光素完全一致” 的無關抗體(如待檢抗體為 Mouse IgG1-PE 抗 CD4,同型對照為 Mouse IgG1-PE 無關抗體),按相同濃度染色。
陽性對照(Positive Control) 確認抗體能正常結合陽性細胞,排除抗體失效或操作錯誤。 若檢測人 CD3,可用已知 CD3 + 的 PBMC 作為陽性對照;若檢測培養細胞的抗原,可用已知高表達該抗原的細胞系(如檢測 HeLa 細胞的 EGFR,可用 A431 細胞(高表達 EGFR)作為陽性對照)。

2. 驗證特異性信號:判斷標準
    完成對照設置后,上流式儀檢測,若滿足以下2個條件,說明抗體適用于該樣本:
    特異性信號峰與同型對照峰的熒光強度差(MFI 差)≥5倍(或通過軟件計算 “陽性細胞比例”,同型對照陽性率<1%,待檢樣本陽性率符合預期);
    陽性細胞的群體分布清晰,無明顯 “拖尾”(拖尾通常提示抗體非特異性結合或樣本碎片干擾)。
 
四、判斷與測試的流程
    第一步:理論篩選:根據樣本類型(PBMC/組織/培養細胞),從抗體說明書中篩選 “種屬匹配、抗原表位適配、推薦樣本類型一致” 的候選抗體;
    第二步:預實驗測試:用目標樣本進行染色,設置空白對照、同型對照、陽性對照,驗證特異性信號;
    第三步:優化調整:若信號弱或非特異性高,調整樣本處理步驟(如縮短酶解時間、更換固定破膜試劑盒)或更換抗體克隆號,再次測試。
 
    通過 “理論篩選+實驗驗證” 的組合,可最大程度確保流式抗體適用于特定樣本,避免因兼容性問題導致實驗結果偏差。

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